高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)是7O年代以后發(fā)展最快的分析手段，從最初 的少數(shù)科研部門掌握到現(xiàn)在的普通生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)室等大規(guī)模應(yīng)用，HPLC 作為質(zhì)量控制，分析化驗(yàn)和有效分離的技術(shù)在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。 HPLC的原理與普通液相色譜是相同的，都是根據(jù)待分析的混合樣品中各個(gè)組分在流動(dòng)相和固定相（即色譜柱）中的分配系數(shù)不同來(lái)達(dá)到分離的目的。
雖然作為一種簡(jiǎn)單的技術(shù)，HPLC仍然存在著可能出錯(cuò)的地方，比如說(shuō)壓力混亂、管道阻塞、和層析柱不能永遠(yuǎn)使用等問(wèn)題。以下來(lái)自著名科學(xué)儀器設(shè)備制造公司W(wǎng)aters Corp和LC Resources的專家提出的幾點(diǎn)HPLC優(yōu)化建議?！?br /> 1． 了解你要用的緩沖液
“人們總是為了對(duì)相同的處方做出了不同的解釋而給我支付昂貴的咨詢費(fèi)。”
——LC Resources總裁Tom Jupille
HPLC依賴于分析物之間的微分均衡，固定相(填料),和流動(dòng)相（溶劑）。常規(guī)的流動(dòng)相一般由50％的乙腈加上50％，10 mM，pH2.5的磷酸鉀緩沖液組成，至少有四種混合它們的方法：正確法、容易法、錯(cuò)誤法和笨方法。
正確的方法應(yīng)該是：按照正確的比例混合10 mM的磷酸和10 mM的磷酸二氫鉀達(dá)到pH 2.5。然后混與等體積的乙腈混合。這個(gè)過(guò)程需要生成標(biāo)準(zhǔn)的操作流程，明確標(biāo)定緩沖液的配方和有效期等。
2．每天更換緩沖液　
水 流動(dòng)相有可能被細(xì)菌，模具和樣品殘留污染，這些污染的出現(xiàn)可能會(huì)升高系統(tǒng)的壓力和提高檢測(cè)儀的檢測(cè)背景，當(dāng)然當(dāng)裝流動(dòng)相的瓶子底部出現(xiàn)混濁的時(shí)候可以很明 顯的發(fā)現(xiàn)這些污染，但是當(dāng)這些污染以薄膜的形式存在于瓶底或者瓶壁則不容易發(fā)現(xiàn)。因此要不每天更換操作的緩沖液，要不確保層析方法中包含10％－15％的 有機(jī)溶劑，減少污染。
3 .防止不合格樣品進(jìn)入層析柱
“盡最大可能使不合格的樣品遠(yuǎn)離層析柱”
——Fred Hutchinson Cancer Research Center的蛋白質(zhì)組主管 Jupille. Philip Gafken
要 分離的樣品一定不能對(duì)層析柱產(chǎn)生傷害，研究人員在進(jìn)行分離之前需要考慮像：鹽是否會(huì)沉淀？去垢劑是否會(huì)包被或者損害填料等等這樣的問(wèn)題，而且專家也建議將 單純的蛋白沉淀步驟（從血漿中分離分析物的通用方法）轉(zhuǎn)換為固相或者液相提取。比如說(shuō)，如果你想尋求有機(jī)藥物代謝物，你可以將樣品與有機(jī)溶劑混勻使所想要 的化合物進(jìn)入溶劑中，而將大量的雜質(zhì)留在水相中。
4.使用保護(hù)柱 
保護(hù)柱或者預(yù)柱是指置于主分析柱前的一根短 （0.5-2 cm），相對(duì)便宜的柱子。花大概80到400元購(gòu)置這樣一根保護(hù)柱可以明顯地延長(zhǎng)昂貴的分析柱的壽命。有研究人員在正常的環(huán)境下進(jìn)行了對(duì)比 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一根柱子可以進(jìn)行1， 000-2，000次填注，而安置了保護(hù)柱之后，柱子可以進(jìn)行10，000次的填注之后仍未出現(xiàn)輕微的改變。而且保 護(hù)柱的填料也應(yīng)該周期性的改變，大約每 200-500次填注后更換一次——假如樣品較臟則應(yīng)該更頻繁更換。
5，不要讓填料保存在水緩沖液中 
在 包含流動(dòng)相的緩沖液還殘留在系統(tǒng)中的時(shí)候切勿關(guān)閉HPLC系統(tǒng)。這是由于溶劑可以蒸發(fā)，留下緩沖液結(jié)晶，最終導(dǎo)致內(nèi)部損傷填料，由此引起一些小毛病。專家 們認(rèn)為用不含溶劑的緩沖液沖洗HPLC系統(tǒng)或者從不關(guān)閉HPLC系統(tǒng)，這樣在其它條件一致的情況下可以延長(zhǎng)柱子壽命，另外把柱子放進(jìn)運(yùn)載溶劑 （shipping solvent）中保存(例如純乙腈)也可以延長(zhǎng)層析柱壽命——因?yàn)檫\(yùn)載溶劑對(duì)柱料的損傷最小。
6.確定“周圍環(huán)境”是指什么 
許 多HPLC方法要求適合的環(huán)境溫度（ambient temperature），但總會(huì)遇到這樣的問(wèn)題：這里的室溫指的是二月的蒙特利爾還是七月的波多黎 各呢？也就是說(shuō)，實(shí)際上HPLC的工作溫度可以是隨心所欲的-4°C到25°C之間的任意溫度。到底什么是合適的周遭環(huán)境，我們必須根據(jù)具體的情況來(lái)確 定，這是因?yàn)樯V法依賴于分析物在固定相和流動(dòng)相之間的平衡進(jìn)行分離，而平衡當(dāng)然依賴于溫度，所以當(dāng)你改變溫度，平衡分布也會(huì)改變，保留時(shí)間改變，可能出 現(xiàn)誤識(shí)別樣品峰。
7．每天檢查系統(tǒng)的壓力　
雖然準(zhǔn)確值依賴于你所使用的方法，但前提是系統(tǒng)的壓力不能明顯的高于或者低于前一天的 壓力，或者說(shuō)不能不穩(wěn)定，比如2，000±10psi可能很不錯(cuò)，而 1,500±700 psi則不適合。研究人員需要經(jīng)常記錄壓力，當(dāng)然許多現(xiàn)代的 HPLC系統(tǒng)具有記錄泵壓力數(shù)據(jù)的特性，這些數(shù)據(jù)在維修中起到不可估量的作用。比如說(shuō)假如說(shuō)有一天你突然在一系列的運(yùn)轉(zhuǎn)中得到許多陰性結(jié)果。有可能是所想 要的樣品峰偏離了它所對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間區(qū)（retention time），這個(gè)時(shí)候你要做的首要事情就是檢查泵壓力的記錄
8.不要在檢查接頭方面省事
不要忽略泄漏。隨著時(shí)間的積累這對(duì)于實(shí)驗(yàn)的影響更大，不僅僅是不方便的問(wèn)題，滲漏使得保留時(shí)間的偏移，導(dǎo)致所想要的樣品峰延遲出現(xiàn)。專家的建議是：至少會(huì)將能見(jiàn)到的接頭都掃視一遍。假如你發(fā)現(xiàn)了滲漏現(xiàn)象，切斷接頭并替換。
9．一次只能更換一樣?xùn)|西　
當(dāng)東西出現(xiàn)問(wèn)題的時(shí)候，切忌一次性換完所有東西。在維修中，應(yīng)該從系統(tǒng)整體出發(fā)，因此不能一次更換預(yù)柱，溶劑，和檢測(cè)燈，而應(yīng)該每次只更換一樣?xùn)|西。
10．每天檢測(cè)　
在你不知道HPLC的日常運(yùn)轉(zhuǎn)情況下，你不可能對(duì)它進(jìn)行維修，所以專家建議每天對(duì)HPLC進(jìn)行檢測(cè)，收集相關(guān)的數(shù)據(jù)。