HPLC流動(dòng)相的緩沖液
緩沖液流動(dòng)相可以根據(jù)下面的操作步驟配制：
將緩沖液藥品溶解在水中制成緩沖液（溶液A）。
用pH計(jì)確定或調(diào)節(jié)溶液A的pH。
將一定體積（如200ml）的有機(jī)溶劑B與由步驟2配制的溶液A（如800ml）混合，制成最終流動(dòng)相（此處的有機(jī)相為20%）。
檢查最終流動(dòng)相的pH（此處為選項(xiàng)）。
由于測定含有有機(jī)調(diào)節(jié)劑的流動(dòng)相pH計(jì)發(fā)生漂移，使其測定pH不很可靠，所以上面的步驟4
一般只有在考察誤差的主要來源時(shí)采用，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室皆略去此步驟。
步驟1一般是將配制緩沖液所用的兩種試劑（A1和A2）分別按計(jì)算量先溶解在水中制成水溶
液， 然后再將這兩種溶液按一定的比例混合得到預(yù)期pH的溶液A。若在此步驟2中調(diào)節(jié)pH，則可以采用溶劑A滴定溶劑B，也可反過來滴定，并通過pH計(jì)測量得到 所需pH的最終緩沖溶液。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中，pH的測量精度通常不會(huì)達(dá)到±0.05—0.1個(gè)pH單位，這會(huì)顯著影響一些樣品的分離。當(dāng)HPLC方法對(duì) pH非常敏感時(shí)，步驟2只能大致確定pH值。
        將準(zhǔn)確稱重的緩沖液配制試劑與精確體積的脫氣蒸餾水混合，使其成為均一的溶液（不進(jìn)一步調(diào)整pH），如此配得得緩沖溶液得pH可以控制在非常窄得范圍內(nèi)（±0.02單位），已知準(zhǔn)確pH值得緩沖液濃溶液已有市售。
        為了改善峰形或塔板數(shù)，有時(shí)在流動(dòng)相中加入酸或堿（如三乙胺、乙酸等），如果這些添加劑并非為配制緩沖溶液時(shí)所采用得試劑，那么將這些試劑加入到流動(dòng)相中后，還需重新滴加酸或堿，使流動(dòng)相達(dá)到所需的pH值。
常用緩沖液的配制
        當(dāng) 緩沖液被稀釋或濃縮時(shí)，pH也應(yīng)不變。其pH值應(yīng)近似恒定不變，或當(dāng)其中的離解的陽離子（K+、Na+）或陰離子（Cl-、Br-）被其它種類的離子替換 時(shí)，表1—4中給出了響應(yīng)的配制方法，平衡陽離子為Na+，緩沖液的最終濃度為0.1mol/l，對(duì)于其它濃度的緩沖溶液或陽離子種類（通常K+）更好， 表中的數(shù)據(jù)也可供參考。較稀的或較濃的緩沖溶液，及包含有不同陽離子的溶液，其pH值會(huì)與表中的數(shù)據(jù)稍有出入。在方法建立過程中，精確的流動(dòng)相pH值往往 并不重要，重要的是每次新配制的流動(dòng)相的pH值與第一次基本相同（最好控制在±0.02范圍內(nèi)）。注意，只有當(dāng)緩沖溶液的pH在緩沖試劑解離常數(shù) pKIa±1范圍內(nèi)時(shí)，緩沖溶液才具有有效的緩沖容量（如乙酸鹽的pKa=4.6，其適宜的pH范圍為3.6—5.6）。
表1 低pH值（25℃）磷酸鹽緩沖溶液的配制方法
溶液A1：0.1M磷酸。配制精確pH值緩沖液時(shí)，所用磷酸需滴定H3PO4的含量。
溶液A2：0.1M磷酸二氫鈉溶液，稱量13.8g NaH2PO4·H2O溶解于水中，定容于1L容量瓶中。        
pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）                pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        
2.0        565        435                2.8        175        825        
2.2        455        545                3.0        110        890        
2.4        345        655                3.2        55        945        
2.6        250        750                                        
表2 不同pH值（25℃）醋酸緩沖溶液的配制方法
溶液A1：0.1M醋酸溶液。6.0g（5.8ml）冰醋酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。
溶液A2：0.1M醋酸鈉溶液。8.2g C2H3O2Na（或13.6g C2H3O2Na·3H2O）溶解于水中定容到1L容量瓶中。        
pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        
3.6        926        74        4.8        400        600        
3.8        880        120        5.0        296        704        
4.0        820        180        5.2        210        790        
4.2        736        264        5.4        176        824        
4.4        610        390        5.6        96        904        
4.6        510        490                                

表3 不同pH值（25℃）檸檬酸緩沖溶液的配制方法
溶液A1：0.1M檸檬酸溶液。21.0g 檸檬酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。
溶液A2：0.1M檸檬酸鈉溶液。29.4g C6H5O7Na3·2H2O溶解于水中，定容到1L容量瓶中。        
pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        
3.0        930        70        5.2        360        660        
3.2        870        126        5.4        320        680        
3.4        810        190        5.6        270        726        
3.6        750        260        5.8        230        764        
3.8        700        300        6.0        190        810        
4.0        660        340        6.2        140        856        
4.2        610        370        6.4        60        940        
4.4        560        440        6.6        40        960        
4.6        510        490        6.8        30        970        
4.8        460        540        7.0        10        985        
5.0        410        590                                
表4 中等pH值（25℃）磷酸緩沖液的配制方法
溶 液A1：0.1M磷酸二氫鈉溶液。13.8g NaH2PO4·H2O溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M磷酸氫二鈉溶液。 26.8g Na2HPO4·7H2O（或35.9g Na2HPO4·12H2O）溶于水中，定容到1L容量瓶中。        
pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        
5.6        948        52        7.0        390        610        
5.8        920        80        7.2        280        720        
6.0        877        123        7.4        190        810        
6.2        815        185        7.6        130        870        
6.4        735        265        7.8        85        915        
6.6        685        315        8.0        53        947        
6.8        510        490                                
表5和6給出了適于pH=7—10.6范圍的兩種有機(jī)堿緩沖液配制方法，這種有機(jī)堿緩沖液可以有效低減緩硅膠基柱的柱效降低。
表5 高pH（25℃）甘氨酸緩沖溶液的配制方法
溶液A1：0.2M甘氨酸。15.01g 甘氨酸溶于水中，定容于1L容量瓶中。
溶液A2：0.1M NaOH溶液，稀釋較濃的NaOH溶液。        
pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        
8.6        25        2.0        9.6        25        11.2        
8.8        25        3.0        9.8        25        13.6        
9.0        25        4.4        10.0        25        16.0        
9.2        25        6.0        10.4        25        19.3        
9.4        25        8.4        10.6        25        22.75        
表6 高pH值（25℃）Tris緩沖溶液的配制方法
溶液A1：0.1M Tris（無堿），12.11g Tris溶于水中，定容到1L容量瓶中。
溶液A2：0.1M HCl溶液，稀釋較濃HCl溶液。        
pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        pH        A1體積（ml）        A2體積（ml）        
7.1        50        45.7        8.1        50        26.2        
7.2        50        44.7        8.2        50        22.9        
7.3        50        43.4        8.3        50        19.9        
7.4        50        42.0        8.4        50        17.2        
7.5        50        40.3        8.5        50        14.7        
7.6        50        38.5        8.6        50        12.4        
7.7        50        36.5        8.7        50        10.3        
7.8        50        34.5        8.8        50        8.5        
7.9        50        32.0        8.9        50        7.0        
8.0        50        29.2